丙酮酸檢測(cè)試劑盒(二硝基苯肼微板法)

一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

丙酮酸(Pyruvic acid，PA)又稱(chēng)2-氧代丙酸，是參與整個(gè)生物體基本代謝的中間產(chǎn)物之一，可通過(guò)乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化，丙酮酸在三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝聯(lián)系中起著重要的樞紐作用。丙酮酸是糖無(wú)氧代謝的產(chǎn)物，科研工作者常將丙酮酸和乳酸一起研究，并用二者的比值推算循環(huán)衰竭的程度。丙酮酸檢測(cè)可采用乳酸脫氫酶催化法或二硝基苯肼比色法。

雅吉生物丙酮酸檢測(cè)試劑盒(二硝基苯肼微板法)檢測(cè)原理是在酸性條件下,丙酮酸與二硝基苯肼反應(yīng)，生成丙酮酸-二硝基苯腙復(fù)合物，后者經(jīng)氧化呈棕紅色，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定520nm處吸光度，據(jù)此通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)比可以計(jì)算出PA水平。該試劑盒可用于檢測(cè)植物、細(xì)胞或組織、血清等樣品中內(nèi)源性的丙酮酸含量,尤其適用植物樣品丙酮酸含量的檢測(cè)。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

二、產(chǎn)品組成：

三、自備材料：

1、離心管或小試管

2、蒸餾水

3、酶標(biāo)儀、96孔板

四、操作步驟(僅供參考)：

1、配制組織勻漿液(1×)∶取10ml組織勻漿液(3×)加入20ml蒸餾水即成。

2、配制PA Assay Buffer (1x)∶取10ml PA Assay Buffer (1.5×)加入5ml蒸餾水即成。

3、準(zhǔn)備樣品︰

①血清、尿液及其他體液樣品:血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，尿液通常也可以直接用于測(cè)定，-20°C凍存。

②組織樣品︰稱(chēng)取1g組織樣品置于勻漿器中，再加入1ml組織勻漿液(1x)仔細(xì)研磨，振搖提取靜置30min ,取上清液4000rpm離心10min ,取上清液,用組織勻漿液(1×)定容至2ml , -20℃凍存，用于PA的檢測(cè)。

③植物材料︰稱(chēng)取1g植物材料置于勻漿器中，再加入1ml組織勻漿液(1×)仔細(xì)研磨，振搖提取,靜置30min ,取上清液4000rpm離心10min ,取上清液,用組織勻漿液(1×)定容至2ml , -20℃凍存，用于PA的檢測(cè)。

④高濃度樣品:如果樣品中含有較高濃度的PA，可以使用原有的裂解液或PBS等進(jìn)行稀釋?zhuān)珉u血清可稀釋5～10倍后檢測(cè)。

4、配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液︰如果檢測(cè)血清、尿液等樣品，按取丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(6mg/ml):蒸餾水=1：99的比例配制，使?jié)舛冗_(dá)到60μg/ml，如果檢測(cè)組織樣品按丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(6mg/ml) :組織勻漿液(1×)=1:99的比例配制，使?jié)舛冗_(dá)到60μg/ml。

a、檢測(cè)血清、尿液等樣品時(shí)，用96孔板按下表操作:

b、檢測(cè)組織樣品時(shí)，用96孔板按下表操作:

5、PA加樣︰按照下表設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的PA濃度過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置平行管。

a、檢測(cè)血清、尿液等樣品時(shí)，用96孔板按下表操作:

b、檢測(cè)組織樣品時(shí)，用96孔板按下表操作︰

6、PA測(cè)定∶混勻靜置10min，其中空白孔呈無(wú)色或淡黃色，標(biāo)準(zhǔn)孔依次呈不同程度的棕紅色。以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀520nm讀取標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔的吸光度值(記為A_{標(biāo)準(zhǔn)}、A_測(cè)定)。

計(jì)算：

以各丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)濃度(1~6號(hào))為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)各丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)A_{標(biāo)準(zhǔn)}為縱坐標(biāo)，繪制丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，血清、尿液等的丙酮酸含量直接根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求得。

組織丙酮酸(μg/g)=A×N/m

血清丙酮酸(μg/ml)=A×N

式中:

A=通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品的丙酮酸濃度(μg/ml)

N=稀釋倍數(shù)

m=樣品的質(zhì)量(g)

注意事項(xiàng):

1、所加試劑順序不可顛倒，先加丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)液，再加組織勻漿液(1×)，最后加PA Assay Buffer(1×)。

2、配制的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)(60μg/m)應(yīng)4°℃避光保存，24h 有效。

3、組織勻漿液有腐蝕性，應(yīng)小心操作。

4、健康成年人空腹靜脈全血丙酮酸含量為3~9μg/ml。

5、如果沒(méi)有酶標(biāo)儀，也可以使用分光光度計(jì)測(cè)定，檢測(cè)樣品量會(huì)相應(yīng)減少。

6、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的各點(diǎn)應(yīng)分布均勻，范圍適中。

7、為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

有效期:6個(gè)月有效。4C運(yùn)輸，4°℃保存。