還原糖檢測試劑盒(斐林比色法)

一、產(chǎn)品簡介：

斐林試劑(Fehling's Reagent)又稱菲林試劑或裴林試劑，是德國化學(xué)家Hermann vonFehling 1849年所發(fā)明，斐林試劑與班氏試劑(Benedict's Reagent)相似，均是用來檢測還原糖的存在，其原理是與可溶性的還原性糖(葡萄糖、果糖和麥芽糖)在加熱的條件下，能夠生成磚紅色的氧化亞銅沉淀。

還原糖檢測試劑盒(斐林比色法)主要由酒石酸鈉鉀、硫酸銅等組成，其測定原理是還原糖具有醛基和酮基，在堿性溶液中煮沸能把斐林試劑中的Cu"*還原成Cu*，使藍色的斐林試劑脫色，脫色程度與溶液中還原糖含量成正比，在590nm下可用比色法測定吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計算出樣品中還原糖的含量，主要用于含淀粉食品、飲料、碳酸飲料、肉制品、蜜餞等食品和植物等樣品中還原糖的定量檢測，總糖的含量也可以測定，但需要提前水解后才能檢測，也可用于還原糖的定性試驗。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

二、產(chǎn)品組成：

三、自備材料：

1、試管或離心管

2、錐形瓶、容量瓶、玻璃珠3、水浴鍋或酒精燈

4、果糖、轉(zhuǎn)化糖等還原糖標(biāo)準(zhǔn)(1mg/ml)

5、鹽酸水溶液、氫氧化鈉溶液

6、10%乙酸鉛溶液、飽和硫酸鈉溶液

7、蒸餾水、碘液

8、分光光度計、比色皿

四、操作步驟(僅供參考)：

1、配置斐林試劑:Fehling's Reagent A液和B液等比例混合即成，不可久置。2、配置pH中和液(1×): pH中和液(10×)和水按1:9比例混合即成。

3、樣品中還原糖的提取∶

1)固體樣品(如含淀粉食品、植物樣品等):稱取粉碎或混勻后的試樣10~20g(精確到0.01g )，置于250ml容量瓶，當(dāng)體積接近150ml時滴加1~3滴甲基紅指示劑，如呈紅色可用pH中和液調(diào)至微黃色;若用風(fēng)干樣品，可稱取3g直接加入容量瓶，加入少量水濕潤后再加水至150ml左右加入指示劑和中和液﹔將容量瓶置于80℃的恒溫水浴中保溫30min，期間搖動數(shù)次，以便將還原糖充分提取出來。對于含蛋白質(zhì)較多的樣品，此時可加入乙酸鉛溶液除去蛋白質(zhì)，至不再產(chǎn)生白色絮狀沉淀時，加入飽和的硫酸鈉溶液除去多余的鉛離子，30min后取出冷卻并定容至刻度，搖勻后取濾液備用。

2)酒料︰稱取混勻后的試樣100g(精確到0.1g )，置于蒸發(fā)皿上，滴加1~3滴甲基紅指示劑，用pH中和液調(diào)至微黃色，在水浴上蒸發(fā)至原體積的1/4后，移入250ml容量瓶，置于80℃的恒溫水浴中保溫30min，期間搖動數(shù)次，含蛋白質(zhì)較多的樣品參考上述方法，濾液備用。

3)碳酸飲料︰稱取混勻后的試樣100g(精確到0.1g )，置于蒸發(fā)皿上，在水浴上微微攪拌除去二氧化碳后，移入250容量瓶，用水洗滌蒸發(fā)皿并入容量瓶，加水至刻度，混勻后備用。4)總糖的水解和提取∶稱取植物樣品0.5~3g，剪碎，加入蒸餾水約3ml勻漿，轉(zhuǎn)移至三角燒瓶，用12ml蒸餾水沖洗研磨器2~3次沖洗液也轉(zhuǎn)移至燒瓶中,向三角燒瓶中加入10ml6M鹽酸溶液，搖勻，煮沸30min，并不時攪拌;取2滴加于小離心管，再滴加1滴碘液，檢查水解是否，如已經(jīng)水解，則不顯示藍色;水解完畢后冷卻至室溫，滴加6M氫氧化鈉溶液，使溶液pH接近中性;含蛋白質(zhì)較多的樣品參考上述方法，濾液或上清液用蒸餾水定容至100ml，混勻，取10ml，用蒸餾水定容至100ml，搖勻備用。

3、制作還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:按下表設(shè)置空白管(0號)、梯度標(biāo)準(zhǔn)管(1~6號)，按順序依次加入。

將各管混勻后，用沸水浴加熱 15min，冷水或自來水冷卻，2500r/min離心5~10min,取上清，1cm比色皿，空白管調(diào)零，用分光光度計測590nm的吸光度值，以各標(biāo)準(zhǔn)管吸光度為縱坐標(biāo)、對應(yīng)葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4、樣品還原糖的測定︰吸取準(zhǔn)備好的還原糖提取液3ml，加入2ml斐林試劑，混勻，沸水浴加熱15min，冷卻、離心、取上清、測定等操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線，空白管調(diào)零后用樣品管的吸光度值帶入回歸方程即可計算出樣品中還原糖的含量。

結(jié)果計算∶

樣品還原糖含量(%)=m×V×N/(mo×Vs×1000)×100

式中:

m=樣品中還原糖的含量(mg)

V=提取液總體積(ml)

N=稀釋倍數(shù)

mo=樣品質(zhì)量(g)

Vs=測定時取用的提取液體積(ml)

1000=單位換算系數(shù)。

附:還原糖的定性試驗

1、配制斐林試劑工作液︰臨用前，取適量Fehling's ReagentA液和B液等量混合即成，即配即用。

2、向潔凈試管中加入1~2ml待測樣品。

3、向該試管中加入1ml斐林試劑工作液，充分搖勻。4、將上述混合液置于沸水浴中，并持續(xù)1~3min。

5、觀察試管內(nèi)混合液顏色是否發(fā)生變化，其顏色變化順序應(yīng)為淺藍色-棕色-磚紅色(沉淀)。

鑒定結(jié)果：

注意事項:

1、樣品提取液中還原糖濃度過高時，應(yīng)適當(dāng)稀釋后再行測定。

2、樣品提取液中還原糖濃度過低時，可提高樣品的濃度或增加提取液的用量。

3、可合理減少或增加提取液和斐林試劑的用量。

4、斐林試劑的A、B液必須分開儲存，臨用前按要求混合使用。

5、斐林試劑B液呈強堿性，需小心操作。

6、6M鹽酸配制∶用市售鹽酸和蒸餾水或去離子水等比例混合即成6M鹽酸，該過程會放熱，應(yīng)小心操作，避免傷人。

7、6M氫氧化鈉配制︰稱取氫氧化鈉24g溶解于蒸餾水，補至100ml即成;氫氧化鈉溶于水會放熱，應(yīng)小心操作，避免傷人。

8、色素對糖類的測定存在干擾，當(dāng)提取液顏色較深時，應(yīng)事先脫色后再進行測定，不同樣品脫色方法和脫色劑用量不同，需自行查找文獻資料，5%活性炭可用于紅葡萄酒的脫色。9、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

有效期∶6個月有效。