293細胞培養技術及應用

是腺病毒載體的包裝細胞。腺病毒是繼逆轉錄病毒后用于基因治療研究的熱門載體。直接將腺病毒載體導入人體內表達目的基因，治療惡性腫瘤，心血管疾病或一些遺傳疾病已取得可喜進展；利用腺病毒載體在包裝細胞 293中表達分泌性蛋白質，如蛋白酪氨酸激酶 1C等亦成為生產重組蛋白的一條途徑。因此完善 293細胞的大規模培養技術具有越來越重要的市場意義。哺乳細胞的大規模培養方式有三種：貼壁培養，微載體培養，無血清懸浮培養。這三種方式均可用于 293細胞的大規模培養。

293細胞特性

293細胞是用5型腺病毒75株系轉化，含有Ad5 E1區的人胚腎細胞。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham與J.S.Miley于1976年用DNA轉染技術構建而成。293細胞是貼壁依賴型成上皮樣細胞，表現出典型的腺病毒轉化細胞的表型，細胞允許Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293細胞為人亞三倍體細胞系。293細胞在無Ca2+或含Ca2+培養基中可同樣生長，也可生長在血清濃度降低的培養基中。

轉瓶培養

轉瓶培養一般用于小量培養到大規模培養的過渡階段，或作為生物反應器接種細胞準備的一條途徑。與傳統靜止單層培養相比，轉瓶具有三大優點：為細胞提供較大的生長表面；輕微的轉動可以防止培養液中形成的某些成分對細胞生長可能產生的影響；細胞大部分時間僅覆蓋一薄層培養液，有利于氣體交換。我們已成功實現293細胞的轉瓶培養。由于293細胞對生長環境的改變較為敏感，細胞容易成團，因此維持穩定的溫度，酸堿度和轉動速度對細胞正常均勻生長至關重要。現在使用的轉瓶培養系統包括二氧化碳培養箱和轉瓶機兩部分。293細胞接種后，維持適當的轉速培養。不同的細胞轉速略有不同。細胞的均勻分散貼壁情況與培養液溫度，瓶子的轉動速度和細胞特性有關。在5-6天的培養周期中，細胞量可增殖20倍。

反應器貼壁培養

此種培養方式中，細胞貼附于固定的表面生長，不因為攪拌而跟隨培養液一起流動，因此比較容易更換培養液，不需要特殊的分離細胞和培養液的設備，可以采用灌流培養獲得高細胞密度，能有效地獲得一種產品；但擴大規模較難，不能直接監控細胞的生長情況，故多用于制備用量較小，價值高的生物藥品。 CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器是常用的貼壁培養式生物反應器，用于細胞的貼壁培養時可使用籃式攪拌系統和圓盤狀載體。此載體是直徑6毫米的無紡聚酯纖維圓片，具有很高的表面積與體積比(1200cm2/g)，有利于獲得高細胞密度。籃式攪拌系統和載體培養是目前貼壁細胞培養使用最多的方式，除用于293細胞的培養外，還用于雜交瘤細胞培養，Hela細胞培養，CHO細胞培養及其它細胞培養。此種方式培養293細胞，細胞接種后貼壁快，接種1小時后細胞貼壁率可達98%以上，采用灌流培養。整個培養周期約7-10天，細胞增殖25-50倍。

微載體培養

微載體是目前最有發展前途的一種動物細胞大規模培養技術，其兼具懸浮培養和貼壁培養的優點，放大容易。目前微載體培養廣泛用于培養各種類型細胞，生產蛋白質產品，如293細胞，成肌細胞，Ve r o細胞，CHO細胞。常用商品化微載體有三種：Cytodex ，Cytopore和Cytoline。 使用較多的反應器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT B反應器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統；NBS公司的CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應器，使用Cell-lift雙篩網攪拌系統。兩種系統都能實現培養細胞和收獲產物的有效分離。微載體培養293細胞，首先要選擇合適的微載體類型和攪拌速度。接種細胞可用1L spinner微載體培養系統或是其它貼壁培養方式準備，采用灌流培養，培養周期10-15天，能達到的細胞密度為5-10×106/ml。

無血清懸浮培養無血清懸浮培養是用已知人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培養方式，它能減少后期純化工作，提高產品質量，正逐漸成為動物細胞大規模培養的研究新方向。要實現293細胞無血清懸浮培養必須先將貼壁培養293改造為懸浮培養293S細胞并尋找適合高密度無血清培養的培養液配方。懸浮培養時，由于缺少血清和蛋白的保護作用，293S對剪切力的敏感度增加，難以達到高密度培養，導致293S產生病毒的數量比貼壁培養低5-10倍左右。細胞接種后，灌流培養7天，達到細胞密度5×106/ml，增殖5-10倍。