1.慢病毒載體概述

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經(jīng)被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。可利用逆轉(zhuǎn)錄酶將外源基因整合到基因組中實現(xiàn)穩(wěn)定表達，具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。
慢病毒基因組進入細胞后，在細胞漿中反轉(zhuǎn)錄為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產(chǎn)生小RNA。慢病毒介導(dǎo)的基因表達或小RNA干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，并隨細胞基因組的分裂而分裂（圖1）。

 

慢病毒載體具有宿主范圍廣，免疫原性低，基因容量大，可以長期表達等特點。能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型的細胞。

慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，達到持久性表達，因而可構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，用于基因的細胞功能研究。使用慢病毒載體改造T細胞可用于CAR-T細胞治療，CRISPR/Cas9文庫構(gòu)建使用的也是慢病毒載體。

2.慢病毒包裝與純化

慢病毒包裝采用三質(zhì)粒或四質(zhì)粒系統(tǒng)進行包裝，收集細胞培養(yǎng)上清，通過超速離心濃縮純化和收集病毒。

3.慢病毒滴度檢測

檢測方法：定量PCR檢測干擾后細胞基因組中外源DNA拷貝數(shù)
實驗原理：慢病毒介導(dǎo)外源基因以逆轉(zhuǎn)錄方式整合進目的細胞基因組

4.慢病毒載體優(yōu)勢

①  表達時間長：慢病毒可將外源基因整合到宿主細胞基因組上，實現(xiàn)基因長時間穩(wěn)定的表達，不隨細胞分裂傳代而丟失，是細胞實驗，常用于構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株
② 安全性高：未發(fā)現(xiàn)致病性，慢病毒載體改造T細胞用于CAR-T細胞治療
③ 免疫原性低：直接注射活體組織不易造成免疫反應(yīng)，適用于動物實驗

5.慢病毒載體應(yīng)用

5.1 體外感染細胞

慢病毒載體能夠有效地感染培養(yǎng)的腫瘤細胞、肝細胞、心肌細胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類型原代細胞和大部分細胞系。慢病毒的感染具有整合特性，能夠?qū)⑼庠椿蛴行У卣系剿拗魅旧w上，因而可以達到持久性表達，從而構(gòu)建穩(wěn)定細胞株，用于基因的細胞功能研究。
體外使用慢病毒感染細胞需要注意，由于每種細胞對慢病毒的敏感性不同，有的容易感染，有的比較難，同時每種慢病毒載體熒光強度也有差異，所以正式實驗前需要做病毒感染預(yù)實驗來確認MOI值以達到理想的實驗效果。
MOI值是multiplicity of infection 的縮寫，即感染復(fù)數(shù)，其含義是感染時病毒與細胞的數(shù)量比值，一般以實驗中某個細胞，感染達到80%，定義為這個細胞的MOI值，即病毒量與細胞數(shù)的比值；加的病毒量(μl)=細胞數(shù)×MOI/滴度(…/ml) ×1000
注意：理論上MOI值越高，慢病毒感染上的可能性越大，感染效率越高，但是這樣對細胞的毒性也越大，因此，預(yù)實驗確認MOI值要在細胞成活率和感染效率中找到一個平衡點。一般如果MOI超過100，甚至200還感染不是，說明慢病毒非常難感染這株細胞，甚至感染不上，考慮換一種方式，如腺病毒或電轉(zhuǎn)。

5.2 體內(nèi)構(gòu)建成瘤模型

體內(nèi)應(yīng)用時，慢病毒可以攜帶目的基因或螢光素酶基因，篩選穩(wěn)定表達的腫瘤細胞株，直接接種構(gòu)建皮下成瘤模型，或通過原位或靜脈注射等方式構(gòu)建轉(zhuǎn)移模型，活體成像檢測用于研究體內(nèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展或轉(zhuǎn)移等。